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NanoFCMlxq新虫 (正式写手)
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[交流]
病毒相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（二）
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今天分享一篇发表在Angewandte Chemie（2021年IF=15.336）上的文章，名为《Label-Free Analysis of Single Viruses with a Resolution Comparable to That of Electron Microscopy and the Throughput of Flow Cytometry》[1]（单个病毒的无标记分析方法，其分辨率与电子显微镜媲美，通量与流式细胞术相当）。 病毒是迄今为止我们星球上最丰富的生物实体。动物病毒众所周知会导致大量致命疾病，而植物病毒病原体每年都会造成全球作物产量的重大损失。另一方面，病毒基因治疗载体的高转染效率及其具有精确形状和大小的单分散结构使病毒颗粒成为强大的药物传递载体和通用的纳米技术构建模块。因此，单个病毒颗粒的高分辨率、高通量分析对于病毒学研究、疾病诊断和治疗以及生物技术和纳米技术的应用具有重要意义。 透射电子显微镜(TEM)历来是确定单一病毒大小和形态的首选方法。然而，样品制备和图像分析所需的繁琐过程，并且成本高，很难常规使用。近年来，许多新开发的单粒子技术已应用于单病毒分析，如表面等离子体共振成像、低通道模式微腔、悬浮微通道谐振器、扫描探针显微镜、电阻脉冲传感和纳米粒子跟踪分析(NTA)。虽然其中一些技术已被证明在各个领域都非常有用，但具有高灵敏度和高分辨率的方法仍有待开发。通过定量其弹性散射光强度，可以对单个病毒颗粒的大小和组成进行实时、无标记的分析。然而，散射光强度与粒子大小的六次方关系，以及与周围介质的低介电对比度，使得区分单个病毒与背景散射极具挑战性。最近，有研究报道了在具有亚波长纳米流体通道的单模二氧化硅纤维中对单个豇豆褪绿斑驳病毒(直径28nm)的无标记跟踪。这是使用纯弹性散射在单个病毒粒子水平上检测到的最小的病毒，但可能存在样本堵塞的严重问题。虽然散射强度尺度的六次方依赖性，干涉技术可以受益于与参考光束的混合，从而允许三次方依赖性。目前已实现了对噬菌体、猴病毒40(直径45nm)空衣壳，甚至单蛋白的检测。 流式细胞术是一种高通量的单细胞分析技术。虽然在单个病毒的检测方面已经做出了很大的努力，但通过无标记光散射测量很难检测到小于80nm的病毒。通过采用鞘流单分子荧光检测策略，我们开发了一种高灵敏度流式检测技术(HSFCM)，可以实时检测直径分别为24nm二氧化硅和7nm金颗粒的光散射。在此，我们报道了一种快速高分辨率的病毒鉴定方法，通过应用HSFCM精确量化来自单个病毒粒子的超弱弹性散射光。 实验室构建的HSFCM如图1a所示。样品流体被水动力聚焦到一个非常细的流(ca. 1.4um），位于锥形毛细管（内径40um，外径240um）的出口处。由于样品流位于远离比色管窗口的地方(一个250um×250um平方孔石英流通道)，并被纯水鞘流包围，通过简单的空间掩蔽，可以有效地阻挡比色管窗口的背景散射。这里，雪崩光电二极管(APD)探测器的小活动面积(ca. 直径180um)作为一个限制孔径，以防止散射在探测体积之外的光到达探测器。噬菌体MS2是一种正二十面体的单链RNA病毒，直径约为27nm，用来评估单病毒检测方法的灵敏度。由于弹性光散射是一个自发的过程，因此利用较高的激发能量密度来增强散射光子的强度。将200mW、532nm连续波激光器的激发光束聚焦到直径约为6.4um(1/e^2)的光点上，得到的激发能量密度为6.2×10^5Wcm^(-2)。图1b显示了通过0.22um过滤的超纯水和MS2病毒的典型侧散射(SS)信号；在这两个信号中，观察到大约1100个计数/bin的连续背景信号(bin宽度为100us)。信噪比(S/N)比率，计算为检测到1min内平均信号高度除以背景信号（噪声）的标准差，计算得到MS2病毒的是11，表明HSFCM将MS2病毒从背景噪声中识别出来，有较高灵敏度。 根据瑞利散射理论，纳米粒子的散射截面不仅取决于粒子的大小，还受折射率对比度的影响，折射率对比度是粒子与介质的折射率比值。一种二氧化硅纳米颗粒（折射率为1.46）在波长为532nm时，比相同尺寸的聚苯乙烯纳米颗粒（折射率为1.59）散射的光少3.8倍。该病毒的确切折射率尚不清楚，但可以假定它为1.45或1.46，这与蛋白质和DNA相似。我们用噬菌体T7，一种二十面体衣壳头部直径约60nm的病毒，和同样大小的硅纳米球和聚苯乙烯纳米球，来评估折射率对单个病毒的光散射检测的影响。 为了避免信号饱和，确保样品流的激发更均匀，激光激发功率衰减到16mW，激光束聚焦到直径为16um(1/e^2)的点，导致背景计数减少约200个计数/bin。噬菌体T7病毒粒子、60nm硅纳米球和63nm聚苯乙烯纳米球的典型SS信号如图2a所示，测量的S/N比分别为94、97和635。与直径为60±?2nm的高单分散的二氧化硅纳米球相比(见支持信息，图S1)，自然产生的噬菌体T7更均匀，光散射强度分布很窄。考虑到散射强度对粒子大小的六次方依赖，T7病毒粒子散射光的12%的变异系数(CV，标准差和平均值的比值)对应于粒径大小的1.9%的变异，这可以归因于实际粒径分布和测量不确定性。T7病毒粒子和60nm二氧化硅球证实了病毒和二氧化硅纳米颗粒具有相当的折射率。63nm的聚苯乙烯比60nm的硅球的散射强度约高6倍，这与增加5.1倍的理论预测一致。 HSFCM用于测定病毒混合物粒径分布采用噬菌体作为模型系统，因为噬菌体是一类最丰富的病毒，安全性高，已成为研究病毒学的基本工具。从研究最广泛的噬菌体科、足病毒科、虹病毒科和肌病毒科中各选择一个噬菌体，并混合。M13、T7、λ和PP01噬菌体的结构尺寸见表1。PP01是一种T2型噬菌体，高特异性感染大肠杆菌O157：H7菌株。典型的SS信号图如图3a所示。SS信号面积分布直方图显示，尽管噬菌体T7和λ的大小差异只有4nm，但这四种病毒可以通过基线分离区分(图3b)。有趣的是，PP01的分布是双峰，这一特征可以归因于尾纤维的收缩或延伸，TEM已证实。 为了从单个病毒的散射强度来测量其实际大小，我们构建了5个直径从43到113nm的单分散硅球的标准校准曲线。当SS信号面积的质心获得的拟合高斯曲线为每个纳米球群体(图3c)绘制一个函数，直径由透射电镜确定(图S3)，确定了散射强度对粒子大小为5.95阶依赖，符合瑞利散射理论(图3d)。利用这条校准曲线，将每个单个病毒的SS信号转换为相应的粒径(图3e)。M13、T7、λ和PP01噬菌体的测定粒径分别为41.8、60.6、74.4和99.6nm。利用动态光散射(DLS)对包含这四种不同类型病毒的病毒样本进行了平行分析，大小分布曲线如图3f所示。对于这四种不同类型的病毒的混合物，只观察到一个峰(图3f中的黑色虚线)。 表1列出了由HSFCM和DLS测量到的这四种类型的病毒的直径，以及等效的颗粒直径(EPDs)。与DLS测定的水动力直径相比，HSFCM测量的光学直径与EPDs较吻合。噬菌体λ的轻微偏差可能归因于病毒通过偏振激光束传递时由其长刚性尾巴引起的定向效应。从测量精度的角度来看，HSFCM的性能优于DLS。例如，对噬菌体T7的测量粒径的标准偏差为1.3nm，而由DLS获得的值的标准偏差大约高出10倍。这些结果表明，通过使用二氧化硅纳米颗粒作为校准标准，HSFCM能够精确地测量病毒大小，其分辨率与透射电镜相当。特别是，每分钟10 000 个粒子，可以在2-3min中获得可靠的尺寸分布曲线。 病毒产品的纯度评估在许多生物技术应用中是必不可少的。从图4a中可以看出，许多粒子可以共存于被野生型噬菌体感染的宿主细胞的裂解液中，包括细胞碎片、DNAfree前端、空衣壳(DNA排出后)和成熟的病毒粒子。图4bi和图ii分别显示了通过聚乙二醇沉淀得到的噬菌体T7粗提物和密度梯度离心后得到的纯化产物的SS信号分布直方图。对于粗提物，假设低散射强度的峰由细胞碎片、前端和空衣壳组成，而高散射强度的峰为成熟的病毒粒子。在我们的HSFCM设置中，流体动力学聚焦的样品流(ca. 1.4um)在激光束的中心区域(16um)内完全照明，可达到近100%的检测效率。因此，可以使用单粒子计数来量化每个群体的丰度，检测到成熟病毒粒子的比例从粗提物中的29.5%提高到纯化后的93.6%。 将HSFCM方法进一步应用于监测病毒基因组的释放过程。图4cii显示，用1.0mNaClO4溶液处理20h后，除了成熟的病毒粒子外，还出现了一个散射强度较低的峰，可以认为是噬菌体T7的空衣壳。当使用1.5m的NaClO4溶液时，空衣壳的数量达到95%。这些结果证实，HSFCM仅仅通过检测单个粒子的散射信号，就可以很容易地区分T7的空衣壳和成熟的T7病毒粒子。NaClO4浓度对T7衣壳产生的影响如图4d所示。为了进一步探究衣壳-基因组之间的相互作用，我们对DNA释放的动态过程进行了监测(图4e)。据报道，DNA从噬菌体排出体外是一个自发的过程，但动力学和热力学都没有完全了解。有趣的是，一旦NaClO4被添加(ca. 从样本注射到分析的1min)，大约13%的病毒粒子完成了病毒基因组的释放，15min后增加到21%。DNA释放的作用速率在前5h增加，释放后降低。20小时后，大约97%的病毒粒子已经完成了其病毒基因组的释放。值得注意的是，T7粗提物中前端的散射信号(图4bi，峰值约为1100个颗粒)略高于成熟病毒粒子DNA释放产生的空衣壳(图4ciii，峰值约为600个)。 总之，HSFCM方法为病毒的高分辨率和高通量表征提供了一种简单而实用的方法。HSFCM的高灵敏度能够检测到直径小于30nm的病毒，并有效区分混合物中不同类型的病毒，在病毒产品制造过程和存储期间分析中可广泛应用。HSFCM在区分同一病毒颗粒的细微结构差异的能力，尤其是噬菌体PP01收缩或扩展尾纤维，空衣壳从成熟T7噬菌体的完全分离，DNA包装前和DNA释放后（空衣壳）的区分，表明HSFCM方法可以是一种有效的病毒学研究方法。然而，值得注意的是，由于有大量散射物体的存在，如在血清或血浆中检测到病毒的情况下，核酸需要荧光染色来区分单个病毒。因此，HSFCM装置的荧光通道可以应用于进一步扩展在许多现实条件下的病毒分析。 文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~ 参考文献： [1]Ma, L; Zhu, S; Tian, Y; et al.Label-Free Analysis of Single Viruses with a Resolution Comparable to That of Electron Microscopy and the Throughput of Flow Cytometry.[J].Angew Chem Int Ed Engl.2016,55(35):10239-43       发自小木虫Android客户端 |
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